Каковы распространённые применения чашек для культивирования клеток в биотехнологии

В современных лабораториях биотехнологии немногие инструменты являются столь же базовыми и широко используемыми, как чашки для культивирования клеток. Эти плоские, круглые, точно спроектированные ёмкости служат основной средой, в которой живые клетки выращиваются, поддерживаются и изучаются в контролируемых условиях. От фармацевтических исследований до регенеративной медицины чашки для культивирования клеток стали неотъемлемой частью научного рабочего процесса, позволяя исследователям воспроизводить сложные биологические процессы вне живых организмов. Их конструкция, обработка поверхности и состав материала тщательно оптимизированы для поддержки адгезии, пролиферации и жизнеспособности клеток в широком спектре применений.

Понимание конкретных областей применения блюда для культивирования клеток в биотехнологии помогает исследователям выбрать подходящий формат для каждого экспериментального требования и принимать обоснованные решения относительно лабораторных расходных материалов. В этой статье рассматриваются основные сценарии применения чашек для культивирования клеток, от базовых экспериментов в области клеточной биологии до передовых процессов производства терапевтических препаратов. Независимо от того, создаете ли вы новую исследовательскую лабораторию или масштабируете процесс биопроизводства, знание областей и способов применения чашек для культивирования клеток эффективно направит ваши решения в области закупок и проектирования экспериментов.

Исследования на клеточной основе и фундаментальные исследования в области биологии

Культивирование и поддержание адгезивных клеточных линий

Одним из наиболее распространенных и важнейших применений чашек для культивирования клеток в биотехнологии является рутинное поддержание адгезивных клеточных линий. Адгезивные клетки, которым требуется твердая поверхность для прикрепления и распластывания перед делением, полностью зависят от обработанной полистирольной поверхности, используемой в стандартных чашках для культивирования клеток. Поверхность обычно покрывается гидрофильным слоем, способствующим прикреплению клеток и достаточно точно имитирующим in vivo-условия тканевой среды для поддержания нормального клеточного поведения.

Исследователи регулярно используют чашки для культивирования клеток для пассажа клеточных линий через определённые промежутки времени, поддерживая запасы хорошо охарактеризованных клеток для проведения текущих экспериментов. Популярные клеточные линии, такие как HeLa, HEK293 и CHO, выращиваются и субкультивируются в чашках для культивирования клеток различных диаметров — обычно от 35 мм до 150 мм. Более крупные чашки обеспечивают большую площадь поверхности для сбора большего количества клеток, тогда как более мелкие форматы идеально подходят для экспериментов, требующих точных условий в небольшом масштабе.

Поскольку среда роста в чашках для культивирования клеток чрезвычайно контролируема, исследователи могут точно регулировать температуру, уровень CO₂ и доступность питательных веществ. Такой высокий уровень контроля делает чашки для культивирования клеток предпочтительной ёмкостью для длительного поддержания клеток как в академических, так и в промышленных биотехнологических лабораториях.

Изучение морфологии и поведения клеток

Помимо простого поддержания клеток в культуре, чашки для культивирования клеток широко используются для наблюдения и изучения морфологии клеток, их подвижности и структурных изменений во времени. Поскольку чашки для культивирования клеток изготавливаются из оптически прозрачных материалов, они совместимы с микроскопией в проходящем свете, фазово-контрастной визуализацией и флуоресцентной микроскопией. Эта прозрачность имеет решающее значение при мониторинге изменений формы клеток, организации цитоскелета или образования клеточных скоплений.

Исследователи, изучающие миграцию клеток, клеточные циклы деления или клеточные стрессовые реакции, регулярно используют чашки для культивирования клеток в качестве платформ для наблюдения. Например, в экспериментах с видеосъёмкой в режиме временной последовательности (time-lapse) клетки выращивают в чашках для культивирования клеток, которые помещают непосредственно на термостатируемую предметную платформу микроскопа, что позволяет в реальном времени отслеживать динамические клеточные процессы без нарушения условий культивирования. Стандартизованная плоская геометрия чашек для культивирования клеток обеспечивает постоянное фокусное расстояние по всей поверхности чашки, что повышает качество изображений и воспроизводимость результатов.

Эти фундаментальные биологические применения в чашках для культивирования клеток обеспечивают первичные данные, лежащие в основе процессов открытия лекарств, токсикологических оценок и механизмов изучения заболеваний на клеточном уровне.

Открытие лекарств и фармакологическое тестирование

Скрининг соединений в высокопроизводительном режиме

В фармацевтической биотехнологии чашки для культивирования клеток служат первоначальной площадкой для испытания новых лекарственных кандидатов. На ранних стадиях библиотеки соединений тестируются на клеточных линиях, релевантных для конкретного заболевания и выращиваемых в чашках для культивирования клеток, с целью выявления молекул, обладающих потенциальной терапевтической активностью. Возможность культивировать большое количество клеток в стандартизированных условиях делает чашки для культивирования клеток эффективной платформой для проведения исследований зависимости «доза–эффект», цитотоксических анализов и экспериментов по связыванию с рецепторами.

Исследователи часто используют чашки для культивирования клеток в сочетании с планшетными спектрофотометрами, автоматизированными системами жидкостного дозирования и платформами визуализации для ускорения сбора данных. Чашки для культивирования клеток большого диаметра позволяют параллельно готовить несколько групп с различными режимами воздействия, сокращая количество отдельных экспериментов, необходимых для получения статистически значимых результатов. Именно такая масштабируемость является одной из главных причин, по которой чашки для культивирования клеток остаются центральным элементом доклинических процессов поиска лекарств, несмотря на появление более сложных трёхмерных моделей культивирования.

Воспроизводимость, обеспечиваемая высококачественными чашками для культивирования клеток, особенно важна на этапах перехода от «хитов» к лидерным соединениям (hit-to-lead) и оптимизации лидерных соединений (lead optimization) при разработке лекарственных препаратов, поскольку незначительные вариации в поведении клеток могут затушевать биологически значимые сигналы и задержать отбор кандидатных соединений.

Оценка токсичности и безопасности

Токсикологическая оценка химических соединений, факторов окружающей среды и новых терапевтических молекул зачастую основывается на клетках, выращиваемых в чашках для клеточной культуры. В пробирочных (in vitro) токсикологические испытания, проводимые в чашках для клеточной культуры, стали ключевым элементом профилирования безопасности как в фармацевтической, так и в химической промышленности, обеспечивая экономически эффективную и этически приемлемую альтернативу или дополнение к испытаниям на животных.

Оценка жизнеспособности клеток, измерение окислительного стресса и обнаружение апоптоза регулярно выполняются в чашках для клеточной культуры. Например, гепатоциты выращивают в чашках для клеточной культуры для оценки лекарственно-индуцированного повреждения печени — одной из главных причин неудач на поздних стадиях разработки лекарственных средств. Первичные человеческие клетки, полученные из различных типов тканей, могут быть засеяны в чашки для клеточной культуры и подвергнуты воздействию тестовых соединений для получения органоспецифических профилей токсичности, релевантных для клинического прогнозирования безопасности.

Широкое использование чашек для культивирования клеток в токсикологических исследованиях отражает их надежность, воспроизводимость и совместимость с широким спектром методов детекции — от колориметрических анализов до проточной цитометрии и протоколов вестерн-блоттинга, выполняемых на клеточных лизатах, полученных непосредственно из чашек.

Вирусология и исследования инфекционных заболеваний

Размножение вирусов и определение их титра

Чашки для культивирования клеток уже десятилетиями играют центральную роль в вирусологических исследованиях. Вирусы не способны к самостоятельному реплицированию и поэтому требуют живых клеток-хозяев, выращиваемых в таких средах, как чашки для культивирования клеток, чтобы завершить свой репликационный цикл. Вирусологи засевают пермиссивные монослои клеток в чашки для культивирования клеток, инфицируют их вирусной суспензией, а затем собирают вирусные частицы из полученного супернатанта по истечении соответствующего периода репликации.

Метод определения титра вируса с помощью бляшкообразования — классический метод, выполняемый непосредственно в чашках для культивирования клеток. Разбавленную вирусную суспензию наносят на конфлюэнтный монослой клеток в чашке для культивирования клеток, после инкубации подсчитывают бляшки — прозрачные зоны гибели клеток, вызванные распространением вируса, — и по их количеству рассчитывают концентрацию инфекционных вирусных частиц. Этот метод, который практически не изменился со времени его разработки в середине XX века, по-прежнему остаётся «золотым стандартом» в исследованиях инфекционных заболеваний и контроле качества производства вакцин.

На этапе разработки вакцин и противовирусных терапий чашки для культивирования клеток служат основным инструментом как для амплификации вирусных штаммов, так и для оценки ингибирующего действия исследуемых соединений на кинетику репликации вируса.

Исследования взаимодействия патогена и хозяина

Помимо простого распространения вирусов, чашки для культивирования клеток используются для изучения молекулярных механизмов, с помощью которых патогены проникают в клетки-хозяева, подавляют их функции и разрушают. Бактериальные патогены, внутриклеточные паразиты и прионы изучаются с использованием монослоёв клеток-хозяев, выращиваемых в чашках для культивирования клеток. Такие эксперименты позволяют исследователям детально изучить факторы вирулентности патогенов, понять иммунный ответ хозяина и выявить новые цели для терапевтического вмешательства.

Для визуализации внутриклеточного пути патогенов и мониторинга вызываемого ими клеточного повреждения к инфицированным клеткам, выращенным в чашках для культивирования клеток, часто применяют флуоресцентное мечение, иммунофлуоресцентную микроскопию и конфокальную микроскопию. Плоская и оптически прозрачная геометрия чашек для культивирования клеток особенно выгодна для получения высококачественных изображений инфекционных процессов на клеточном уровне.

Пандемия COVID-19 ускорила глобальные инвестиции в инфраструктуру исследований инфекционных заболеваний, а чашки для культивирования клеток стали центральным элементом первоначальных усилий по выращиванию SARS-CoV-2, изучению его репликации в клетках человеческих дыхательных путей и скринингу библиотек противовирусных соединений в поисках перспективных терапевтических препаратов.

Биология стволовых клеток и регенеративная медицина

Расширение и дифференцировка стволовых клеток

Биология стволовых клеток представляет собой одну из наиболее требовательных и стремительно развивающихся областей применения чашек для культивирования клеток. Как плюрипотентные стволовые клетки — включая эмбриональные стволовые клетки и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, — так и стволовые клетки взрослых тканей требуют специализированных условий культивирования, которые должны обеспечивать чашки для культивирования клеток. Для многих типов стволовых клеток химический состав поверхности чашки модифицируется белками внеклеточного матрикса, такими как матригель, фибронектин или ламинин, с целью обеспечения адгезии клеток и поддержания их недифференцированного состояния.

Масштабное расширение стволовых клеток для производства терапевтических препаратов зависит от стабильной и воспроизводимой работы чашек для культивирования клеток в сотнях или даже тысячах отдельных культуральных сосудов. Любые отклонения в обработке поверхности, качестве материала или допусках по размерам могут привести к изменчивости эффективности размножения клеток, что, в свою очередь, влияет на последующие протоколы дифференцировки и выход терапевтически значимых популяций клеток.

Протоколы направленной дифференцировки, при которых стволовые клетки направляются к определённым клеточным линиям — например, кардиомиоцитам, гепатоцитам или нейральным предшественникам — также, как правило, инициируются и проводятся в чашках для культивирования клеток. Чашка служит контролируемой средой, на которой тщательно скоординированные по времени добавления факторов роста и небольших молекул направляют решения клеток относительно их судьбы на каждом этапе временной шкалы дифференцировки.

Тканевая инженерия и развитие органоидов

В то время как традиционные чашки для культивирования клеток поддерживают двухмерные монослоевые культуры, последние достижения в области биотехнологии расширили их применение на трёхмерные культуральные системы. Чашки для культивирования клеток с низкой адгезией и неадгезивными поверхностями используются для стимуляции самосборки клеток в сфероиды и органоиды — миниатюрные трёхмерные модели тканей, которые точнее, чем стандартные плоские культуры, воспроизводят архитектуру и функции человеческих органов.

Сфероиды опухоли, выращенные в неадгезивных чашках для культивирования клеток, применяются для моделирования объёмных опухолей в трёхмерном пространстве и позволяют воспроизвести гипоксическую зону в центре, пролиферирующую периферию и некротический центр, характерные для реальных опухолевых масс. Эти более физиологически релевантные модели всё чаще используются при разработке противоопухолевых препаратов для повышения точности прогнозирования ответа на лекарственное воздействие in vivo по сравнению со стандартными монослоевыми анализами, проводимыми в обычных чашках для культивирования клеток.

Для применения в тканевой инженерии с целью получения трансплантируемых тканей чашки для культивирования клеток служат исходной платформой для посева клеток перед их переносом на каркасы или в биореакторные системы. Подготовка, характеристика и контроль качества клеточных популяций, используемых в этих протоколах регенеративной медицины, в значительной степени зависят от чашек для культивирования клеток как основного сосуда для культивирования.

Биопроизводство и производство рекомбинантных белков

Транзиентная трансфекция и экспрессия генов

В биотехнологическом производстве чашки для культивирования клеток широко используются на стадии разработки процессов производства рекомбинантных белков и вирусных векторов. Эксперименты по транзиентной трансфекции, при которых плазмидную ДНК, кодирующую целевой белок, вводят в клетки млекопитающих, рутинно проводятся в чашках для культивирования клеток в исследовательских масштабах до переноса процессов в биореакторы для крупномасштабного производства.

Возможность точного контроля плотности клеток, концентрации реагента для трансфекции и дозы ДНК в пределах заданной площади поверхности чашек для культивирования клеток делает их идеальными для оптимизации условий экспрессии генов. Исследователи могут параллельно оценивать несколько конструкций промоторов, реагентов для трансфекции и условий инкубации с использованием чашек для культивирования клеток единого формата и высокого качества, получая данные, необходимые для определения оптимального производственного процесса до начала дорогостоящего масштабирования.

Чашки для культивирования клеток, используемые в этих приложениях, должны соответствовать строгим требованиям к качеству, включая низкий фон флуоресценции для считывания результатов на основе визуализации и минимальное содержание извлекаемых химических веществ, которые могли бы помешать биологическим анализам или последующим аналитическим измерениям уровней экспрессии белков.

Разработка клеточных линий и отбор клонов

На этапе разработки клеточных линий для производства биологических препаратов исследователи выделяют и оценивают отдельные клонированные линии, полученные из трансфицированных клеток. Чашки для культивирования клеток используются на нескольких стадиях этого процесса — от посева трансфицированных популяций при низкой плотности с целью выявления колоний, образовавшихся из одной клетки, до расширения отобранных высокоэкспрессирующих клонов для дальнейшей характеристики. Плоская открытая поверхность чашек для культивирования клеток позволяет легко визуально идентифицировать отдельные колонии под микроскопом и вручную отбирать их для выделения и последующего расширения.

Рабочие процессы разработки устойчивых клеточных линий опираются на чашки для культивирования клеток как основной сосуд для первоначального образования колоний под действием селективного давления, которое, как правило, достигается путём добавления селективных антибиотиков в питательную среду. В ходе последовательных пассажей в чашках для культивирования клеток неэкспрессирующие клетки погибают, тогда как устойчивые интегранты продолжают пролиферировать, что позволяет исследователям выявить клонированные линии с наибольшей продуктивностью для масштабирования в производственные биореакторы.

Качество, стерильность и однородность чашек для культивирования клеток, используемых на этих этапах, напрямую влияют на показатель успешности программ разработки клеточных линий, что делает выбор поставщика и обеспечение качества продукции критически важными факторами для команд, занимающихся разработкой биофармацевтических препаратов.

Часто задаваемые вопросы

Какие размеры чашек для культивирования клеток наиболее распространены в биотехнологических лабораториях?

Чашки для культивирования клеток выпускаются в нескольких стандартных диаметрах; наиболее широко используются форматы диаметром 35 мм, 60 мм, 100 мм и 150 мм. Более мелкие чашки предпочтительны для экспериментов, требующих небольшого количества клеток или дорогостоящих реагентов, тогда как более крупные чашки применяются при необходимости получения высоких выходов клеток для последующих этапов, таких как экстракция белков, выделение РНК или исследования обработки соединениями в масштабе, требующем больших объёмов. Выбор диаметра чашки обычно определяется масштабом эксперимента, доступным местом в инкубаторе и объёмом питательной среды, необходимым для поддержания жизнеспособности клеток.

Чем отличаются обработанные чашки для культивирования клеток от необработанных?

Обработанные чашки для культивирования клеток подвергаются модификации поверхности — обычно с помощью коронного разряда или плазменной обработки, — в результате которой повышается гидрофильность поверхности полистирола, что способствует адсорбции белков и прикреплению клеток. Обработанные чашки подходят для большинства адгезивных типов клеток, которые естественным образом прикрепляются к компонентам внеклеточного матрикса. В противоположность этому, необработанные или низкоадгезивные чашки для культивирования клеток имеют поверхности, препятствующие связыванию белков и прикреплению клеток, что делает их пригодными для суспензионных культур, формирования сфероидов и развития органоидов, поскольку неконтролируемое прикрепление клеток может нарушить систему культивирования.

Можно ли повторно использовать чашки для культивирования клеток после стерилизации?

Стандартные чашки для культивирования клеток изготавливаются как одноразовая лабораторная посуда и не предназначены для многократного использования. Автоклавирование или химическая стерилизация могут изменить поверхностную химию чашек для культивирования клеток, что приведёт к нарушению адгезии клеток, изменению оптической прозрачности и потенциальному введению химических загрязнителей, влияющих на жизнеспособность клеток или результаты экспериментов. Для исследований, требующих многократно используемых поверхностей культивирования, доступны специализированные чашки со стеклянным дном или специально предназначенные многоразовые ёмкости для культивирования с подтверждёнными протоколами стерилизации; тем не менее одноразовые чашки для культивирования клеток остаются отраслевым стандартом в большинстве лабораторных условий благодаря их удобству и гарантированной стерильности.

Из каких материалов обычно изготавливаются чашки для культивирования клеток?

Подавляющее большинство чашек для культивирования клеток, используемых в биотехнологии, изготавливаются из полистирола медицинского качества — материала, выбранного благодаря его оптической прозрачности, стабильности размеров, лёгкости модификации поверхности и низкой стоимости производства. Некоторые специализированные чашки для культивирования клеток изготавливаются из сополимеров циклических олефинов, которые обеспечивают превосходные оптические свойства для передовых задач визуализации. Чашки для культивирования клеток со стеклянным дном объединяют основание в виде стеклянного покровного стекла со стенками из пластика, обеспечивая оптические характеристики стекла при сохранении привычного формата стандартных чашек для культивирования клеток; поэтому они особенно популярны в рабочих процессах конфокальной и сверхразрешающей микроскопии.